Agregación plaquetaria con serotonina como método indirecto de función serotoninérgica. M. Carretero*, E. Gómez**, G. Escolar*, C. Gastó** * Servicio de Hemoterapia y Hemostasia ** Subdivisión de Psiquiatría y Psicología Médica. Hospital Clínico y Provincial. Barcelona	ARTÍCULO ORIGINAL [Resumen] [Abstract]
	Introducción Material y Método Resultados Discusión Conclusiones

Comunicación presentada en las 2as. Jornadas de Actualización en Psiquiatría (Palma de Mallorca, 1996).
Trabajo reproducido con permiso de los autores.

Introducción

Los trastornos psiquiátricos están siendo ampliamente asociados a alteraciones en la función serotoninérgica (1). Dada la dificultad inherente del estudio in vivo de la función serotoninérgica central, se ha investigado su correlación con parámetros periféricos en busca de métodos indirectos para su evaluación en pacientes psiquiátricos. Entre estos métodos indirectos destacan en la actualidad las pruebas neuroendocrinas (2) y los estudios en plaquetas (3).

Las plaquetas han sido propuestas como modelo periférico de neuronas serotoninérgicas por diversos autores dado que tienen igual origen embriológico, similar biosíntesis de serotonina y presencia en su membrana citoplasmática de moléculas transportadoras de serotonina y de receptores 5-HT₂ (4). Ello ha contribuido a realizar diversos estudios sobre estos receptores serotoninérgicos plaquetarios mediante técnicas tales como el binding (5) y la agregación plaquetaria inducida con serotonina (6).

La agregación plaquetaria puede ser inducida por diversos agonistas como ADP, colágeno y aminas biógenas. La membrana plaquetaria posee receptores 5-HT₂ y adrenoceptores que tras ser activados por agonistas específicos como serotonina (5-HT) y adrenalina, respectivamente, provocan la agregación de las plaquetas (7, 8, 9). Se ha encontrado una correlación entre la magnitud de la respuesta de agregación con 5-HT y la densidad de los receptores 5-HT₂ en la membrana plaquetaria (10). Sobre la base de ello, se ha postulado que seria posible determinar diferencias en la agregación plaquetaria inducida por 5-HT como método indirecto de la función de los receptores 5-HT₂. Diversos investigadores han utilizado esta técnica en el estudio de patologías médicas (11, 12, 13, 14) y psiquiátricas (15, 16, 17, 18, 19, 6)

El objetivo de este trabajo es la reproducción y evaluación de la agregación plaquetaria con 5-HT como fase preliminar para su aplicación en el estudio de trastornos psiquiátricos.

Material y Método

Muestras de sangre de 10 ml fueron obtenidas de 20 sujetos controles, 13 mujeres y 7 varones (edad media = 39,5 ±11,8), elegidos al azar entre los donantes del Banco de Sangre del HCP de Barcelona. Los estudios de agregación plaquetaria fueron realizados con plasma rico en plaquetas (PRP) obtenido tras la centrifugación de la sangre anticoagulada con citrato trisódico 3,8% (1:9) a 200 g durante 10 min. El sobrenadante restante se centrifugó a 2.000 g durante 20 minutos para obtener plasma pobre en plaquetas (PPP) que fue utilizado para calibrar el 100% de transmitancia en el agregómetro (Aggrecoder PA-3210, Menarini). Alícuotas de 225 ml de PRP fueron depositadas en cada cubeta del agregómetro a las que se añadieron 25 ml de los agentes inductores de la agregación manteniendo la incubación durante 5 ó 10 minutos. La determinación de la agregación plaquetaria se llevó a cabo mediante el método turbidimétrico de Born (20). Se realizaron varias pruebas iniciales con diversas concentraciones de ADP (0,1- 4 mM, Menarini Diagnósticos) y 5-HT (0,1-50 mM, Serotonin hydrochloride Fluka, Chemie AG) en un número escaso de sujetos. Posteriormente se estandarizaron las siguientes combinaciones para cada sujeto con concentraciones fijas de ADP 0,5 mM y 5-HT 0,5 mM: 1) ADP y 5-HT solos, 2) 5-HT y a los 5 minutos ADP 3) ADP + 5-HT inmediatamente.

Las determinaciones protocolizadas se realizaron por triplicado para cada muestra y como valor final se utilizó la media para cada variable. El grado de agregación plaquetaria fue cuantificado como el porcentaje máximo de agregación para cada agonista combinación de agonistas. Para el análisis de los datos se descartaron aquellas determinaciones cuya agregación máxima con ADP solo fuera superior al 50%. En la comparación de resultados se utilizó la t de Student para datos apareados, y la prueba U de Mann-Whitney cuando las variables no se distribuían con normalidad por el bajo número de casos. El programa estadístico empleado fue el Primer of Biostatistics (Mc Graw-Hill Inc; versión 1988).

Resultados

En las condiciones descritas se obtuvieron los siguientes resultados:

1. La serotonina induce una agregación leve (X ± DS=7,7 ± 4,3 %; n=19) y reversible en el primer minuto (Fig. 1)
2. La inducción con ADP tras incubación de las plaquetas con 5-HT durante 5 minutos no potencia la respuesta de agregación al ADP (X ± DS= 30,8 ± 7,2 % vs 23,1 ± 9,4 %; n=10; p= NS). (Fig. 2)
3. La inducción con ADP a dosis umbrales de agregación (agregación < 50%) seguido inmediatamente por 5-HT potencia la respuesta (X ± DS= 27,3 ± 11% vs 68,7 ± 29,1 %; n=18; p< 0.001). (Fig. 1)

Figura 1 Curvas típicas de agregación plaquetaria por 5-HT, ADP y ADP más inmediatamente 5-HT.

Figura 2 Curva característica de agregación plaquetaria por ADP tras incubación con 5-HT durante 5 minutos.

Discusión

La serotonina es un Monista demasiado débil poder para establecer comparaciones entre sujetos. Para potenciar su efecto y aplicarlo en el estudio de pacientes psiquiátricos, diversos autores han utilizado la inducción previa de la agregación plaquetaria por serotonina con dosis umbrales de ADP como prueba de función serotoninérgica. Mc Bride et al. (6) encuentran una correlación entre la agregación con 5-HT inducida por concentraciones umbrales de ADP y el número de receptores plaquetarios 5-HT₂ determinados mediante la técnica de binding con LSD-I¹²⁵. Mc Adams y Leonard (19) comparan la agregación con diversos agonistas en pacientes depresivos, esquizofrénicos y maniacos. Vanags et al. (11) estudian la potenciación entre agonistas y la inhibición con antagonistas específicos como la ketanserina. Otros autores han utilizado esta técnica de agregación plaquetaria en el estudio de un posible factor plasmático presente en la depresión que impide la receptación de serotonina en las plaquetas (21, 22, 23).

En este estudio se han reproducido es que demuestran que la agregación por serotonina sola es débil (19, 13) y que puede ser potenciada con ADP a dosis umbrales de agregación (10, 21, 11, 6) . Existen no obstante, diferencias con los estudios previos en las concentraciones y parámetros utilizados en las comparaciones.

En este trabajo las concentraciones idóneas para visualizar la débil agregación producida por serotonina estuvieron comprendidas entre valores de 0,1-10 mM. Para conseguir una agregación máxima menor del 50% las concentraciones de ADP adecuadas se hallaron entre 0,1 y 1 mM. En este caso se protocolizó la concentración de 0,5 mM por ser un valor intermedio que habitualmente causa una agregación menor del 50%. Concentración de 5-HT en el rango de 0,5-50 mM fueron igualmente efectivas como amplificadoras de la agregación plaquetarias con concentraciones umbrales de ADP; sin embargo, se decidió utilizar la más baja por ser similar a la concentración fisiológica de 5-HT intraplaquetaria

El parámetro de la curva de agregación utilizado en este estudio para realizar comparaciones fue el porcentaje máximo de agregación. En contraste, Mc Bride et al. (6) cuantifican la diferencia del área bajo la curva, Mc Adams et al. (21) miden la máxima pendiente de la curva de agregación y Vanags et al. (11) comparan curvas dosis-respuesta utilizando el valor EC_50% (concentración que induce el 50% de la agregación máxima).

Conclusiones

La serotonina es un inductor leve y reversible de la agregación plaquetaria. No obstante, se puede obtener una amplificación y cuantificación del efecto de la 5-HT en la agregación plaquetaria mediante la potenciación con dosis umbrales de ADP. Concentraciones favorables para ello han sido ADP 0,5 mM + 5- 0,5 mM. Estos datos sugieren que la agregación plaquetaria con 5-HT, amplificada con dosis umbrales de ADP, es un método adecuado para ampliar y cuantificar la respuesta de agregación con 5-HT.

Se puede concluir que a pesar de las limitaciones inherentes a la técnica y a la variabilidad en los diferentes sujetos, existen ventajas comparado con las técnicas de binding para los receptores 5-HT2 como son la facilidad de su reproducción, el escaso coste económico y la ausencia de riesgos médicos. Sobre la base de ello, parece posible utilizar la técnica de agregación plaquetaria amplificada con 5-HT como método indirecto para la evaluación aproximada de la funcionalidad de los receptores 5-HT2.

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